L’analisi chimica della canapa industriale, processo indispensabile per la titolazione del Δ9-THC e per la valutazione della sua legalità, negli ultimi tempi presenta una ricorrente criticità in ordine alla qualità del risultato analitico trasmettendo dubbi e sospetti sulla serietà tecnico-scientifica dei laboratori chimici consultati. Ciò alimenta forte preoccupazione nei produttori e venditori sia sotto il profilo commerciale ed economico che legale. Sovente succede che campioni di canapa della stessa specie ed appartenenti allo stesso lotto, analizzati da laboratori diversi, risultino avere una percentuale di Δ9-THC diversa. Alcuni con un modesto scarto (+/- 0,01% – 0,02 %), altri più marcato (0,1% – 1%).
La causa di tale diversità può essere ricondotta:
1) al metodo analitico-strumentale utilizzato dal laboratorio chimico. Attualmente molti centri di analisi si avvalgono di strumentazione analitica di ultima generazione, di altissima qualità ed attendibilità (liquido/massa LC-MS e gas/massa GC-MS) a fronte di quanto riportato dai regolamenti europei per la determinazione del Δ9-THC (Regolamento CEE n. 421/86 della Commissione del 25 febbraio 1986; Regolamento CEE N.1164/1989, Allegato C; Regolamento CE N. 1177/2000, Allegato C; Regolamento CE N. 1122/2009, Allegato I). Questi, per la quantificazione del Δ9-THC, fanno esclusivo riferimento al cromatografo in fase gassosa munito di rilevatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID), uno apparecchio che, seppur in campo da diversi decenni, è sempre attuale come principio chimico-fisico. Il GC-FID, più semplice sotto il profilo dell’utilizzo della LC-MS e della GC-MS, è un strumento di sicura affidabilità e riproducibilità tanto da essere ampiamente impiegato da strutture delegate dall’Autorità Giudiziaria per le analisi degli stupefacenti sequestrati (Polizia Scientifica, R.I.S. Carabinieri, Dogane, Istituti di Medicina Legale, ecc.).
In ordine all’analisi della canapa occorre fare una premessa: come è noto, la pianta produce cannabinoidi nella forma acida. Quando si applica il calore o l’illuminazione ultra-violetto (UV) questi, per decarbossilazione, perdono una molecola di CO2 cambiando la loro forma in quella neutra.
Quando si analizza un campione ai fini del riscontro della sua legalità, si deve determinare la percentuale del THC totale. Questa è la somma della percentuale del Δ9-THC, più quella THCA (THC acido), moltiplicata per un fattore di conversion. Perdendo una molecola di CO2, il THCA si trasforma in THC, molecola più piccola e meno pesante (THCA pesa 358 grammi/mol, mentre il THC pesa 314 grammi/mol). Facendo il rapporto tra i due pesi, avremo: 358/314 = 0,877 che corrisponde alle molecole di THC per molecola di THCA.
La cromatografia liquida ad alta prestazione (LC-MS) non impiega calore in nessuna fase dell’analisi strumentale. Questa si svolge a temperature ambiente e, di conseguenza, i campioni non vengono decarbossilati. I componenti della miscela iniettata provenienti dall’estrazione della canapa vengono separati nei singoli cannabinoidi (Δ9-THC, Δ9-THC acido, CBD, CBD acido, CBN, ect.). Per ottenere il valore del THC totale, è necessario applicare una formula che tenga conto della decarbossilazione. Quindi, il modo corretto di calcolare la percentuale di THC totale (e di CBD totale) con la LC-MS è:
% di THC Totale = % di THC + (% di THCA x 0,877)
Lo stesso principio viene applicato per il calcolo della percentuale di CBD totale:
% di CBD Totale = % di CBD + (% di CBDA x 0,877).
Diversamente, quando i campioni vengono analizzati mediante la cromatografia in fase gassosa (GC-FID) non è necessario applicare alcuna formula in quanto, essendo la miscela contenente i cannabinoidi esposta a temperature molto elevate, la reazione di decarbossilazione avviene interamente in una parte dello strumento (iniettore). Nel metodo ufficiale del “Regolamento CE n. 1177/2000 del 31 maggio 2000, all. C”, è riportata una temperature dell’iniettore di 300ºC, parametro fisico in cui la reazione di decarbossilazione ha luogo per intero.
Pertanto, l’impiego di strumentazione scientifica con principio separativo chimico-fisico diverso, potrebbe originare risultati non uguali. Sarebbe necessario, al fine di evitare incongruenze che tutte le strutture deputate a queste indagini si adeguassero alla normativa comunitaria (uso del GC-FID). Bisogna tener conto che ogni metodica e/o strumentazione analitica utilizzata, più attuale o uguale a quella citata dalla normativa, presenta capacità risolutive, valori di accuratezza e precisione propri tale da poter generare, sullo stesso campione ed entro certi limiti, un risultato dissimile. Pertanto, anche nell’ambito dell’utilizzo del GC-FID, non è escluso che possano presentarsi delle difformità nella determinazione della % del Δ9-THC totale dipendente da alcune importanti variabili quali la manutenzione dello strumento analitico (qualità e usura della colonna cromatografica, pulizia dell’iniettore e del rilevatore FID), le condizioni di lavoro strumentale (in particolare la temperatura dell’iniettore) e il processo estrattivo preliminare (anche se quest’ultimo esula dal corretto funzionamento strumentale).
Altro punto critico nella determinazione della percentuale del è la campionatura. Questa importante e delicata fase rappresenta l’inizio del processo chimico-analitico dove una errata procedura può originare un risultato non veritiero. In chimica analitica il campionamento è definito come “l’operazione di prelevamento di una sostanza, di un materiale, di una matrice ambientale, di volume e composizione tali che le proprietà misurate nel campione, così definito, rappresentino entro un certo limite accettabile, le stesse proprietà della matrice originaria.” Quindi il campione prelevato e consegnato al laboratorio, dove rappresentare il materiale in toto. Come deve essere fatta una campionatura è scritto nei regolamenti comunitari e nazionali: per il D.Lgs 242/2016, gli esami per il controllo del contenuto di Δ9-THC delle coltivazioni devono sempre riferirsi a medie tra campioni di piante, prelevati, conservati, preparati e analizzati secondo il criterio prescritto dalla vigente normativa dell’Unione europea e nazionale di recepimento, e le varietà di canapa per le quali è autorizzata la coltivazione, devono presentare un tasso di Δ9-THC inferiore allo 0,2% nelle parti verdi di un campione standardizzato calcolato secondo il metodo definito dai regolamenti comunitari (Regolamento CEE n. 421/86 della Commissione del 25 febbraio 1986; Regolamento CEE N.1164/1989, Allegato C; Regolamento CE N. 1177/2000, Allegato C; Regolamento CE N. 1122/2009, Allegato I). Cito testualmente: il metodo serve a determinare il Δ9-THC delle varietà di canapa (Cannabis sativa L.). A seconda del caso in esame, il metodo è applicato secondo la procedura A o la procedura B descritte in appresso. Il metodo si basa sulla determinazione quantitativa per cromatografia in fase gassosa (GC) del Δ9-THC dopo estrazione con un solvente adatto.
La procedura A è applicata per i rilevamenti a livello della produzione previsti dall’articolo 39 del regolamento (CE) n. 73/2009, (nota a pag. 72): il tenore di Δ9-THC di una varietà è determinato mediante analisi di un campione portato a peso costante. Il peso di THC considerato rispetto al peso del campione non deve essere superiore allo 0,2 % ai fini della concessione dell’aiuto. Il campione di cui sopra, è composto dal terzo superiore di un numero rappresentativo di piante prelevate a caso al termine della fioritura e private dello stelo e dei grani.
La procedura B è applicata nei casi di cui all’articolo 39, paragrafo 1, del regolamento (CE) n. 73/2009 e all’articolo 40, paragrafo 3, del presente regolamento.
Prelievo di campioni.
Procedura A: in una popolazione di una determinata varietà di canapa si preleva una parte di 30 cm contenente almeno un’infiorescenza femminile per ogni pianta selezionata. Il prelievo deve essere effettuato durante il periodo compreso tra il ventesimo giorno successivo all’inizio e il decimo giorno successivo alla fine della fioritura, di giorno, secondo un percorso sistematico (griglia N.d.A.) in modo che il campione raccolto sia rappresentativo della particella, esclusi i bordi. Lo Stato membro può autorizzare il prelievo del campione durante il periodo compreso tra l’inizio della fioritura e il ventesimo giorno successivo all’inizio della stessa, a condizione che, per ciascuna varietà coltivata, vengano prelevati altri campioni rappresentativi, in conformità al primo comma, durante il periodo compreso tra il ventesimo giorno successivo all’inizio e il decimo giorno successivo alla fine della fioritura.
Procedura B: in una popolazione di una determinata varietà di canapa si preleva il terzo superiore di ogni pianta selezionata. Il prelievo deve essere effettuato durante i dieci giorni successivi alla fine della fioritura, di giorno, secondo un percorso sistematico in modo che il campione raccolto sia rappresentativo della particella, esclusi i bordi. Nel caso di una varietà dioica, occorre prelevare solo le piante femminili.
Dimensioni del campione.
Procedura A: il campione è costituito dai prelievi effettuati su 50 piante per particella.
Procedura B: il campione è costituito dai prelievi effettuati su 200 piante per particella.
Dalla disamina di questo documento è chiaro che un numero così alto di campioni da analizzare, seppur corretto e da rispettare, rappresenta un significativo impegno economico che non tutti i coltivatori e venditori di canapa sono in grado o vogliono sostenere. Ritengo che un numero minore di questi (15 per la procedura A e 30 per la procedura B) possa rappresentare la particella o il lotto di acquisto ed essere sufficienti per ottenere un valore medio attendibile di Δ9-THC.
La buona pratica analitica asserisce che la campionatura deve rappresentare il 10% dell’intero reperto (nel caso delle infiorescenze da analizzare, la normativa UE richiede minimo il 20%). In una coltivazione, sia outdoor che indoor, il prelievo deve essere fatto seguendo un percorso sistematico predisponendo una griglia di raccolta, ovvero dividendo il terreno in più quadrati uguali (non meno di 15) evitando di includere le piante poste ai bordi e su ognuno eseguire un prelievo di infiorescenze, quelle più ricche di resina, in modo di avere il contenuto massimale di Δ9-THC. Bisogna essere consapevoli che esiste una estesa variabilità, a volte modesta in altre più significativa, della presenza di Δ9-THC nelle piante di canapa, perfino in quelle appartenenti alla stessa semenza, dipendente da molteplici fattori quali la zona geografica, il clima, il momento della raccolta, l’umidità, l’esposizione alla luce, i parassiti, la qualità del terreno, la distribuzione dei nutrienti e la capacità della pianta ad assorbirli. Per tale motivo, al fine di superare la diversa distribuzione del principio attivo ed avere una uniformità del reale contenuto di Δ9-THC è necessario eseguire una campionatura ampia e rappresentativa. Minore è il numero di campioni prelevati maggiore è la probabilità di errore di valutazione della percentuale di Δ9-THC. Non è corretto chiedere al laboratorio chimico la caratterizzazione della piantagione, della canapa acquistata o dei suoi derivati quando vengono consegnati un esiguo numero di campioni da analizzare (1-5). Questi non potranno mai rappresentarla e non potranno mai fornire un reale contenuto di Δ9-THC. Molti produttori o venditori di infiorescenze e di derivati dalla canapa (alimenti, cosmetici, ecc.), usano il risultato della singola analisi con esito favorevole (Δ9-THC < allo 0,2%) per pubblicizzare e vendere il loro articolo, comunicando che è “norma di legge” la cui determinazione proviene da una struttura qualificata e certificata. Non sempre è così. E’ un azzardo di cui il laboratorio declina ogni responsabilità. Per questo, visto la “leggerezza” di alcuni clienti nel contravvenire la normativa, il laboratorio comunica che l’esito riguarda esclusivamente il campione consegnato, fornendo un semplice dato analitico senza fare alcun riferimento alla particella o al complessivo del lotto. E’ chiaro che a fronte di una richiesta di analisi, anche singola, il laboratorio la esegue ma, sulla base di quanto sinora esposto, non risponderà mai di un impiego scorretto del risultato o di un esito diverso proveniente da una controanalisi.
